Enzyme này hoạt động bằng cách tấn công, thủy phân và phá vỡ liên kết glycosidic trong thành peptidoglycan. Enzyme này cũng có thể phá vỡ các liên kết glycosidic trong chitin, mặc dù không hiệu quả như chitinase thực sự. [8]

Vị trí hoạt động lysozyme gắn với phân tử peptidoglycan bằng khe nổi bật giữa hai miền của nó. Nó tấn công peptidoglyan (được tìm thấy trong thành tế bào vi khuẩn, đặc biệt là vi khuẩn Gram dương), cơ chất tự nhiên của nó, giữa axit N-acetylmuramic (NAM) và nguyên tử cacbon thứ tư của N-acetylglucosamine (NAG).

Các saccharide ngắn hơn như tetrasaccharide cũng có thể là một cơ chất khả thi nhưng thông qua một trung gian với một chuỗi dài hơn. [9] Chitin cũng đã được chứng minh là một cơ chất hữu hiệu cho lysozyme. Các cơ chất nhân tạo cũng đã được phát triển và sử dụng trong nghiên cứu về lysozyme. [10]